为了研究效果叶提取物控制香椿上灰霉病，叶樟在石油醚中浸渍（沸点60〜90℃） 95％乙醇，乙酸乙酯和无菌水，以获得不同的溶剂。品的影响毒力4种灰霉病的香椿提取物通过速度croissance.Lextrait石油醚高的抗菌活性的方法确定过滤并通过研究萃取活组织法。培对收获后灰霉病发病率，病斑直径和抗病酶活性的影响。果表明，石油醚提取物对番茄灰霉病菌的菌丝生长有很强的抑制作用。EC50值为3.09 mg / mL，其毒力显着高于其他处理。度为20 mg / mL时，香料枇杷叶石油醚提取物的抗菌率达到94.11％。体内试验中，石油醚提取物能有效抑制采后灰霉病的发病率和病斑直径，且抗菌作用与浓度成正比; 100 mg / mL的石油醚提取物可显着提高果实的PAL值，PPO和POD的活性可提高果实抵抗真菌病害的能力。键词：Botrytis cinerea;香椿;抑菌作用;保护酶分类号：S482.2，S436.63文献编码：AA文章编号：0439-8114（2011）04-0723-04Effet抑制剂抗葡萄孢菌樟属樟树叶提取物和其上的酶protectricesDUAN效果丹平1，乔永jin1，2，卢立-SHA1，王海红2，陈召良2（医学工程医学与工程，上海理工大学的1.College，上海2 0093，中国;农业科学院，上海201106，中国）摘要：以研究灰霉病樟脑樟属，石油醚，95％乙醇，乙酸乙酯的叶提取物的效果用无菌水处理Cinamomum camphora的叶子。过体外菌丝体生长速率评估四种提取物对灰霉病菌的毒性作用。外，在体内测试石油醚提取物对疾病发病率，病变直径和酶活性的影响。果表明，石油醚以20mg / ml的浓度的提取物具有的EC 50 = 3.09毫克/ ml和94.11％在所有的提取物的抗真菌率最好抑制效果在B. Cinerea。体内，石油醚提取物可以显着减少疾病和病变直径的感染。
外，
香樟树抑制效果与提取溶液的浓度成比例。后，在100毫克石油提取物/ ml的可促进苯丙氨酸氨裂合酶（PAL），多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD）的活动，改善在草莓的抗真菌活性。键词：灰霉病，樟属香樟，抗真菌作用的叶片，由疾病引起的保护酶灰霉病灰霉是草莓的收获后的主存储[1]。前，低温杀真菌剂，包装气体，辐射和化学杀真菌剂可以防止在一定程度上灰霉病的外观，但由于成本高，高残基和灰霉病有一个速度高繁殖和抗药性。且能够在低温（0°C）[2，3]下繁殖，使这些方法难以推广。着对食品安全问题的日益重视，开发稳定且安全的毒性杀菌剂已成为控制草莓病的研究重点。
Cinamamom Camphora属于蚜科（Aphididae），是中国亚热带地区常绿阔叶树种的一部分。产品具有驱虫，防腐和抗痰的功能[4]。椿叶散发出强烈的气味aromatique.Elle包含98种化学品，包括黄酮类和甾醇，其具有抗细菌，抗真菌和抗病毒，并且可以在医学中使用。也可以用作杀虫剂或杀菌剂[5-7]。现在已经知道，香椿叶有很大的药用价值，但对提取物对采后草莓灰霉病菌的抑制作用研究尚未见报道在国内还是国外。于此，本实验中使用了冷浸泡方法，使用不同的溶剂樟脑叶的提取物来研究在贮存期间灰霉病和抗病性的阻力，以提供杀真菌剂的某些源贮藏期间灰霉病的防治。学依据。料和方法。1材料在上海市农业科学院收集试验片，并在50℃的烘箱中彻底干燥，并喷洒超细喷雾。莓来自上海市青浦区赵泾市的草莓植株，没有肥料或病害。
相同的损害，成熟和大小水果被带到实验室收获后立即：灰霉病从水果草莓收集并在恒定的温度，以促进孢子形成在25℃下温育1至2天。显微镜下分析形态结构和观察后，证实它是灰葡萄孢（Botrytis cinerea）。孢子在PDA培养基上分离和纯化，并储存在4℃的冰箱中备用。2采用冷浸法制备香椿叶提取物的方法[8]。柠檬叶样品喷洒，并且每个在室温下充电和5倍，用石油醚（沸点60〜90℃），95％乙醇，乙酸在室温下使用乙基和无菌水并提取3天。滤，将残余物和5次浸出3天的溶剂的量的过滤，然后通过抽吸过滤，并重复3次，将滤液合并3次，通过蒸发浓缩成稠膏，并将浓缩物单独地确定用于浸出的溶剂。体积为100ml时，获得浓度为1.00g / ml的测试溶液，密封并在4℃下储存。
3.香椿叶提取物抗菌活性的测定。3.1使用生长速率法测定体外生物活性[9]。灭菌的PDA培养基熔化，冷却至约50℃和5毫升每种测试样品的移液在含有45毫升培养基的单独灭菌的干燥锥形瓶中，搅拌和摇动。入培养皿中，以制备含有药物在20.00，10.00，5.00，2.50，1.25毫克/毫升，分别和与穿孔孵育浓度（一个板= 5毫米）。过刺穿了良好的菌落放置真菌的菌丝体的一侧的外边缘，接种介质的中心准备细菌饼和在培养皿添加20.00毫克/相应的溶剂中的溶液作为对照，每次治疗重复3次。在25℃的培养箱中当在验证板的菌落只要靠近板的壁的地方，菌落的直径进行测定，并通过十字交叉法平均。
制菌丝生长的速率根据下式计算：菌丝体生长抑制率=×100％根据不同浓度的抑制率的，换算成概率值（），分数每个处理的体积质量（mg / ml）的由对数值（x）的代替，使用分析软件SPSS17.0，发现毒力回归方程，并计算EC 50。3.2体内测定生物活性的选择整齐美观草莓，没有寄生虫或疾病或机械损坏，用70％乙醇溶液消毒和通风它干。2mm（长）的伤口×1毫米（宽度）×2毫米（深）已穿孔与接种针与伤口表面处理的水果在100，50的浓度接种和25毫克/毫升。20μl石油醚提取物处理溶液在无菌水中干燥（约2小时）。种约1.0×10 5个细胞/ ml的相同体积的病原体孢子悬浮液。草莓储存在19厘米×13厘米×4.5厘米的纸箱中，并用0.02毫米的聚乙烯薄膜包装。它们置于恒温恒湿的培养箱中，相对湿度为95％，相对湿度为20℃。次处理40个果实，重复3次。5天后，计算果实的发病率和病变的直径。4. 4种香味叶提取物对与抗病性相关的草莓果实酶活性的影响。4.1酶活性的影响接种方法与1.3.2相同。4个治疗组：未接种的草莓和未接种为对照，只有果实上刺伤果刺伤用20微升的约1.0×105颗粒/ ml的孢子悬浮液和接种，刀伤后，浓度为20μL。种100mg / mL樟脑提取物并在干燥后接种相同体积的病原体悬浮液。理所述水果后，将其放置在一个恒定的温度和湿度培养箱在20℃下的约95％的相对湿度为100种水果，花10种水果随机（取肉在该疾病的结）每24小时。量酶活性并重复三次。溶液的活性的4.2制备和测定取5克草莓浆，添加一些聚乙烯吡咯烷酮（PVP），并加入0.1摩尔/ L硼酸缓冲液（10毫升，pH8.8的，含有10毫摩尔）/ L巯基乙醇，5毫摩尔/升EDTA），在冰浴中研磨，以10 000转/分钟离心15分钟，上清液用于测定酶活性。丙氨酸氨裂解酶（PAL）的活性通过栗喝升[10]的方法测定，并在A290变化为在酶的活性（1U）的单元0.01 H 1。取5克草莓浆，添加一些PVP，添加10毫升，0.1摩尔/ L磷酸盐缓冲液（pH 6.4），在冰浴中研磨，在1000转/分钟离心15分钟，使用上清液。活性的测定确定多酚氧化酶（PPO）的活性根据栗期嗯[11]的方法进行，作为酶活性的一个单位的0.01 A420 1分钟的变化。过氧化物酶（POD）的活性通过愈创木酚的方法[12]来确定，以1分钟为0.01 A470变化为酶活性的单位。5统计学分析采用SPSS17.0软件，测试数据采用ANOVA进行Duncan多重比较分析。果和分析。1从试验结果确定香椿叶提取物对番茄灰霉病菌的生物活性（表1）。以看出，香椿的四种叶提取物在相同浓度下对灰霉病有不同程度的抑制作用。这些条件下，香椿叶提取物对草莓灰霉病有显着的抑制作用（P <0.05）。20mg / mL的浓度，抑制率达到94.11％，分别86.29％，73.15％和52.90％，其中叶香椿石油醚提取物中华绒螯蟹具有最高的抑制率，并且显着更高。椿叶中其他三种提取物的抑制率均为相同剂量。据总体趋势，香椿四叶提取物的抗菌作用与浓度呈正相关，随着浓度的增加而增加。过含有药物低，白色菌丝生长潜力菌丝体介质的生长来看，生长量是罕见的，菌丝呈短和投影中央菌丝和瘢痕外围菌丝的现象出现了。照菌丝（无菌水）致密，均匀，大部分形成孢子。2显示了香椿叶提取物对番茄灰霉菌菌丝体的毒力。椿四叶提取物的浓度与抗菌效果和浓度增加的抗菌效果呈正相关。渐改善。灰葡萄孢的4种提取物香椿EC50值分别为17.39±3.09毫克/毫升。
据EC50值，抗菌力4香椿提取物的顺序，用石油醚萃取>醋酸。酯提取物> 95％乙醇提取物>用水提取。此，确定用于提取研究中使用的樟脑叶的最佳溶剂是石油醚。草莓表3的疾病灰霉病香椿的石油醚提取物的3抑制作用表明不同浓度的石油醚香椿提取物对具有抑制的不同程度的灰葡萄孢（Botrytis cinerea）及其浓度增加。强了重要的抑制作用。20℃下储存5天后，用100mg / ml处理的草莓没有发生任何疾病。50毫克/毫升和25毫克的发病率/ mL的30.83％和83.33％，69.17或和低于对照16.67分，病变分别为的直径6.67和13. 67 mm且控制比达到显着水平（P <0.05）。表明来自樟脑叶的石油醚提取物对草莓灰霉病具有显着的抑制作用。4.香椿石油醚提取物对草莓病害酶活性的影响。草莓果实的PAL活性不同处理4.1影响如图1中所示，在草莓PAL活性先升高，然后在储存期间减少，然后第二天，活动每次治疗达到最大值，只有刺伤和刺。感染的和接种病原体的PAL活性分别是对照的为1.33和1.46倍，而接种的提取物的PAL活性和组接种病原体的最高，证人的1.13倍。此之后，PAL活性下降，但接种和接种病原体提取物的PAL活性优于其它处理和从一组刺伤和病原体显著不同（ p <0.05）。表明病原体的刀伤和接种可以促进ALP收获后的草莓，但樟树提取物，能够进一步提高PAL活性草莓和增强抗病能力。4.2不同处理对草莓果实PPO活性的影响如图2所示，PPO草莓活性随着保质期的延长先降低后增加。储2天后，用接种物的提取物处理的草莓的PPO活性越高病原治疗组接种和刀伤口与病原体接种分为320和304 U / g，与对照组有显着差异（P <0.05）。存储后的第三天，提取物和接种病原体的PPO活性均354.66，420.00和457.33 U /克，分别，这比用剂的伤口显著更高接种病原体。表明接种的病原体的接种物提取物和处理组可以比接种病原体更多地增加草莓的PPO活性。培养期间，单刀组和对照组之间的PPO活性没有显着差异。4.3不同处理对草莓POD活性的影响如图3所示。整个贮藏期间，草莓的POD活性先增加后减少。对照组相比，每个治疗组在第3天具有最高峰，比对照组晚1天。果实老化到一定程度时，POD活性下降，但接种提取物和接种病原菌处理的草莓的POD活性下降最慢。第5天，POD活性是刺伤和接种病原体组的2.33倍。
着水平（p <0.05）。论和讨论在本实验中，使用生长速率的方法，发现用溶剂的四个不同的香椿提取物对灰霉病一些抑制作用。的与香椿石油提取几种不同的溶剂提取物具有最好的抗菌作用：20.00毫克条件/ mL时，抑制率达到94.11％和EC50只有3.09。Mg / mL代表含水提取物的17.78％。油醚被选为溶剂为樟脑片的活性材料，其示出了樟脑片石油醚提取物施加在灰霉病和上的控制效果处理过的草莓的发生率和伤害浓度为100 mg / mL。理浓度显着低于50和25 mg / mL的草莓具有明显的防治效果。
没时，它们经历一系列生理和生化反应，如木质素的合成，大量的酚类物质的形成和：植物中天然到由病原体引起的机械损坏或感染响应其他次级代谢产物，从而增强其免疫力。
[13-15]。实验表明，香椿叶石油醚提取物可以增强草莓果实防御酶的活性，增强果实抗病能力。PAL是木质素和异黄素中植物抗毒素合成的关键酶，可增加植物对病原体感染的抵抗力[16，17]。PPO可以将酚类物质氧化成对致病菌具有高毒性的萜类化合物，从而保护植物细胞免受病原体的侵害[18，19]。POD主要从植物中去除H2O2，在防御植物病害的防御系统中发挥重要作用[20]。该实验中，每个处理可以提高PAL的活性，PPO和POD草莓到不同程度，包括与病原体提取物和剂处理的果实的PAL，PPO和POD的活性比的显著更高仅病原体刺伤的治疗优于对照。表明只有刺伤和接种病原体可以增强三种防御酶的活性，并且果实防御酶的活性更高加入提取物后。然，樟脑叶提取物可以增强草莓防御酶的活性，增强水果的抗真菌能力。研究证实，香椿叶石油醚的提取物包含抑制灰霉病在活性的二次生物质，而且分离和纯化，香椿杀菌活性成分的结构鉴定，以及对其他植物病原真菌的抑菌作用和作用。制等尚未研究过。
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