为了研究PKS基因的樟化合物之间的关系，基因组分析的研究获得芝樟聚酮化合物合酶基因，该序列包含特异于模型设计的起始密码子和终止密码子的引物和驰樟cDNA进行作为模板，以获得一个非常降低克隆PKS（HR-PKS）全长基因，称为AcPKS2; AcPKS2基因生物信息学分析和在不同环境中的基因表达比较。果表明：AcPKS2全长7842碱基对，内含子24，外显子2613氨基酸编码293.5 kDa的，等电点的等电5.78点的蛋白相对分子质量。表明，该基因属于HR-PKS，布置在现场的组织KS-AT-DH-MT-ER-KR-ACP-TE，活性位点的8个区域的面积进行了分析酮β-组合酶CDD（DTACSSSL），酰基转移酶（GHSIGETA），脱水酶（RNDGSTSPL），甲基转移酶（SFDIITAFDV），烯酰还原酶（HAGVSSPAA），酮还原酶（GSPGQANYTAA），酰基转移酶（YGLDSLTSVRL）硫酯酶（KQPNGPY）。示系统发生树AcPKS2与称为HR-PKS蛋白聚糖，域和系统发育分析的其它化合物表明，该基因可以编码含有非常降低聚酮化合物合酶新域TE，分析能够诱导基因表达的葡萄糖和果糖的表达。键词：樟，PKS非常小的，生物信息学分析，基因CLC的表达：Q939.92文献代码：A文章编号：1000-3142（2018）09-1146-09Abstract：我们分离聚酮化合物合成酶基因与anlyzing樟芝设计特异性引物，包括该基因的DNA序列的密码子起始和停止密码子功能的基因组中。后用cDNA樟芝一个PKS基因的全长克隆，它是HR-PKS的一部分和任命AcPKS2。们用生物信息学方法分析AcPKS2基因及其蛋白质序列，并与AcPKS2基因在不同的媒体文化的表达水平。结果表明，基因AcPKS2是7842个碱基，包括内含子24，所有外显子编码的2613种氨基酸，其相对分子量为293.5千道尔顿，理论等电点（pI）是5.78的结果保存（CSD）域数据库分析显示，该组织的面积为AcPKS2 KS-AT-。DH-MT-ER-KR-ACP-TE，八个方面的活性位点β-酮合成酶（DTACSSSL），酰基转移酶（GHSIGETA），脱水酶（RNDGSTSPL）甲基转移酶（SFDIITAFDV），烯酰还原酶（HAGVSSPAA的）酮还原酶（GSPGQANYTAA），分别酰基carier蛋白（YGLDSLTSVRL）硫酯酶（KQPNGPY）。
统发育分析表明，AcPKS2和另一个HR-PKS系统发育树的，他们的产品没有确定分组，域和分析可以anthenticated AcPKS2该基因编码一个新的HR-PKS域其中包括TE 。因表达的分析显示，葡萄糖和果糖可提高文字的能力expression.Key基因AcPKS2：樟芝，大大减少了聚酮化合物合酶，生物信息学，聚酮化合物的基因的表达（聚酮，PK ）是最重要的次级代谢产物之一，它现在很清楚的结构有超过7000种的聚酮药物对市场超过20种（考克斯，2007; Hertweck，2009）。酮化合物合成聚酮化合物合酶功能（聚酮化合物合酶，PKS），其催化该过程类似于脂肪酸合酶（脂肪酸合酶，FAS）的脂肪酸的合成，即辅酶A活化的底物脂肪酰基和不同的重复的大量衬底，富次级代谢物的结构（Seshime等人，2005;沉，2003）之间形成的脱羧缩合，结构相对简单的芳族（例如，酸苔色，6-甲基水杨酸，等）聚酮化合物复杂减小结构高度（例如，毒素T，洛伐他汀等）（秀树等人，2010）。
菌PKS主要是在Ⅰ型聚酮化合物合酶，在他的不同的区域可以分为型PKS非真菌Ⅰ减少PKS（非还原PKS），部分还原的PKS（部分还原PKS），高度降低PKS（非常简单PKS） （Kroken等，2003，Sato等，2017）。伐他汀（洛伐他汀）（Ma等人，2009），细胞松弛素（Cytochalasans）（Scherlach等人，2010），并主要是通过降低催化PKS合成高度从真菌聚酮的碳骨架衍生等（柳等，2017）。PKS在高度上的酶的分离且独立的功能结构域可以重复使用减少，在广泛合酶（斯拉等人，2007）分离的区域可具有（光晕等人，2008）聚酮化合物减小的不同组合。从土曲霉（土曲霉）衍生的具有药学洛伐他汀胆固醇降低活性（Ma等人，2009）;哺乳动物潜在鲨烯合酶抑制作用，可有效地感染神经元朊病毒聚酮萨拉哥酸及其化合物A（萨拉哥酸A）[表演者鲨鱼和内皮抑素S1（S1 squalestatin）]（治疗Bonsch等人，2016;柳等，2017）;强烈减少聚酮化合物HR-PKS过SS酮合酶（KS），酰基转移酶（AT），酰基载体蛋白（ACP）PKS三种基本结构到外部，还具有与合成转化β相关联的酮基 - 还原酶（KR），脱水酶（DH）和烯酰基还原酶（ER），新合成的β-酮基β-还原成醇，脱水α-β不饱和链烯酰基，双亚甲基键被还原成为组（考克斯，2007; 2009年Hertweck，Kroken等人，2003; Sato等人，2017）。克斯＆辛普森（2009）根据产品结构和催化的方式，HR-PKS分为两类：一种是合成的大环内酯，例如洛伐他汀，另一个形成酯NRPS接头肽，例如比镰刀菌链脲佐菌素。展具有由特定于该保守序列T.（甲基）单元设计的引物，并克隆他汀类药物的角鲨烯抑素生物合成有关的PKS基因的化合物和聚酮化合物合酶，Cox等人（2004）之间的初始相关性。了研究基于基因组数据，分离和克隆到樟聚酮化合物合酶（AcPKS2）的全长cDNA的基因的其分析PKS基因的樟化合物之间的关系，方法AcPKS2生物信息学分析遗传测量AcPKS2加入的不同碳源和氮源中间的基因的表达水平为了进一步调查樟基因异源聚酮化合物合酶的表达，并且基座基因的固有接触AcPKS2化合物材料与方法材料从菌株分离芝台湾芝的子实体购买的木材，形态及ITS鉴定为樟，应变号LKYAC01获得。与麦芽糖（麦芽酵母提取物，USA BD）为培养物的繁殖25℃介质的酵母提取物的孵化器。条件（25℃）的提取试剂盒（康世纪）与RNA的植物是从樟菌丝提取总RNA牛樟芝30的培养菌丝体采取的完整樟AcPKS2方法全长基因的克隆，使用紫外分光光度计NanoDropTM 2000（US的Thermo Fisher）确定RNA浓度和质量和反向cDNA的转录成储存在-80℃用于RNA。
基因组数据相关芝序列以获得由生物合成，通过使用该基因费希尔行程序连接的基因AcPKS2聚酮化合物的全长cDNA序列，设计包含起始密码子（AcPKSF0）和密码子判断一对特异性引物的（AcPKSR0）（表1）的cDNA克隆。AcPKSR0到AcPKSF0和引物，使用高保真聚合酶后（高保真DNA聚合酶）进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳和克隆载体片段，筛选并对阳性克隆进行测序。AcPKS2基因和蛋白质AcPKS2使用在线程序NCBI ORF查找程序，该程序BLAST序列同源性比较的分析，蛋白质的protParam的物理和化学性质的基因的开放阅读框的预测的生物信息学分析（等电点，分子量），使用4.1 SIGNALP预测具有信号肽服务器，预测的亚细胞定位与蛋白数据库搜索NCBI数据库的结构域的结构域的目标P AcPKS2交谈了。述PKS较高的蛋白质与其他真菌的选择和樟AcPKS同源序列蛋白序列后，使用MEGA 6.0软件开发系统和同源性分析氨基酸序列的分析，一个的Clustal W比对程序，
香樟树程序使用邻位joinging系统树构造，重复1000次，默认情况下选择的其他参数。用网站的在线生物信息学工具，如表2先前的研究小组分析了呈现在各种媒体牛樟AcPKS2基因的表达表现出不同的碳源和氮源和配方媒体对增长率牛樟一个显著的影响（Zhao等，2016）。据以往的研究结果，第一选择1-11 MEDIUM AcPKS2基因表达实验，在表3所示芝菌丝快速增长的商业SEM的具体配方和介质（麦芽提取物13克·L -1），一个PDA（马铃薯粉状提取物5g·L-1，葡萄糖20g·L-1），WB（麦芽提取物15克·L-1，麦芽糖12.75克·L 1），SA（葡萄糖20g·L-1），和TMG（粉状番茄提取物10g·L -1，麦芽糖5克·L-1，葡萄糖10g·L-1），以验证AcPKS2基因的表达。据所选择的配置中的载体的制剂，并用牛樟芝，在25℃40 d的保育箱的菌丝体接种被放置，从而获得0.5g的各介质的牛樟芝的每个真菌菌丝体的，将样品重复3次，以总RNA的RNA的真菌提取物描述提取试剂盒（康世纪）。照樟总RNA逆转录的第一链cDNA的转录试剂盒说明书（Transgen）的合成，和-20℃冰箱保存备用。后，引物特异性TacPKS1F，TacPKS1R（表1）在樟AcPKS2生长在一个特定的基因，进行琼脂糖凝胶电泳的不同载体表达检测，使用图像分析软件分析积分光密度GENE-SNAPS，并定量分析相对表达。樟AcPKS2的全长基因分析的方法得到的结果反转录成cDNA牛樟芝作为模板和引物AcPKSR0 AcPKSF0的总RNA真菌菌丝体，使用高保真聚合酶（DNA聚合酶高保真获得）恢复7842个碱基的cDNA后获得的经琼脂糖凝胶电泳检测出约7.5kb的长度的片段的PCR扩增和克隆后测序。
BLASTP比对显示褐色的cDNA粘附倍孔菌基因（的褐褶菌属褶菌，XM_.1），电缆形孔菌根（Fibroporia radiculosa，XM_.1），褐腐病的病原体（ Moniliophthora roreri，XM_.1）等真菌DNA序列具有70％，72％和73％的同一性，并且该基因AcPKS2的名称聚酮化合物合酶。用cDNA AcPKS2和DNA序列的比对表明，该基因24，2613种氨基酸和编码外显子的内含子。AcPKS2蛋白质序列的在线预测程序的protParam物理 - 化学性质的蛋白质序列AcPKS2的生物信息学分析，分子量293.5千道尔顿，5.78电点等电点，在式C13133H20526N3534O3895S101，不稳定系数39.66作为稳定蛋白质，脂肪91.54系数，平均0.013亲水性的，亲水性低;分析服务器SIGNALP 4.1表明，信号肽不存在，非分泌蛋白;使用P目标在线软件预测的亚细胞定位，线粒体存在的可能性0.216，0.050分泌途径，其他0788的位置，三的可靠性，服务器结合测定SIGNALP 4.1，这表明蛋白质存在于最大概率的细胞质基质中。蛋白质的序列CDD预测域已经表明，含有KS-AT-DH-ER-MT-KR-ACP-TE作为结构域（图1）的蛋白质。
应于发现的区域中的樟AcPKS2与其他聚酮化合物合酶减小的高度进行比较的活性位点的八个方面AcPKS2是β-酮基合成酶（DTACSSSL的），酰基转移酶（GHSIGETA），酶脱水（RNDGSTSPL），转移甲基（SFDIITAFDV），烯酰还原酶（HAGVSSPAA），酮还原酶（GSPGQANYTAA），酰基转移酶（YGLDSLTSVRL）硫酯酶（KQPNGPY）（图2）。子系统AcPKS2蛋白质在蛋白质和AcPKS2的序列使用Clustal W比6.0 MEGA程序系统发生分析的蛋白PKSⅠ其它真菌多序列比对的序列的31型，使用构建系统发生树邻接，1000次重复，默认选择其他参数。
果表明（图3）在：PKS未减数作为外部基准组，高度PKS的降低可分为5组，蛋白质序列樟AcPKS2与折叠孔菌棕色密度（褐褶菌属褶菌， XP_.1）韧细菌毛发（韧陆地棉XP_.1）和褐腐病病原体孢子（Moniliophthora roreri，XP_.1）是聚乙烯，合成产品目前并不清楚。化枝Ⅰ进一步分成区域KS-AT-DH-ER-KR-ACPⅠA，ⅠB两个亚组，该组ⅠA（ACP），T-毒素环的合成;场组装IB族KS-AT-DH-ER-KR-MT-ACP，合成毒素单环（例如，2-吡咯烷酮）。KS-AT-DH-MT-SDR-ER-KR（AMP-ACP）的组CladeⅡ场，产生洛伐他汀基芯。KS-AT-DH-MT的CladeⅢ区（CSD）-ER-KR-ACP，大环内酯类聚酮的合成。Ⅳ域进化枝KS-AT-DH（MT）-ER-KR-ACP，合成伏马菌素型内核。第一组Ⅴ樟AcPKS2其中比较所述蛋白质的序列中，只有整个TE结构域的存在，合成的产物可能是一个新颖的聚酮化合物。和根据以前的研究团队氮樟AcPKS2基因表达的各种来源的添加剂的作用，对各种媒体牛樟芝的菌丝生长速率有很大的不同（Zhao等人，2016 ）。丝牛樟芝在17个不同的培养基中温育后25℃培养箱中培养40 d，提取的RNA反转录成cDNA，并使用特异性引物（表1）检测表达。果表明（图4：A）：分析所述测试不同的碳添加剂，果糖（FRU）和葡萄糖（谷氨酸）AcPKS2能够诱导基因表达，以及在介质中最小（无）中，添加甘露糖（人）未在载体上和乳糖（LAC），其中，最大添加的葡萄糖培养基的基因表达的量表达;在添加剂氮的测试分析（图4B），麦芽糖和葡萄糖为。源的条件下，氮源可以诱导不同的基因表达，但也有在表达水平显著差异，表达的通过的下降所引起的电平酵母提取物（MFY2），马铃薯蛋白胨（MFS），通过浸入粉末牛肉（MFB），酪蛋白胨（MFL），胰蛋白胨（MFY1），番茄提取物粉末（MFT）其中的最高五倍量的诱导表达和MFY2 MFT中最低之间的相位差。
管使用该基因的表达的商业测试不同的手段，结果表明（图4：C）：TMG最高表达诱导量降序YMB，WB，PDA，SEM，SA。论牛樟芝（樟芝）拥有多孔菌科（多孔菌科）牛樟芝（樟芝）蘑菇是唯一的我们宝贵的台湾食品和医学真菌（Lu等，2014年，吴等，2004）。富含具有生理活性的次级代谢产物如樟特定聚酮化合物卓凯A的子实体，因为A（antrocamphin A）（Hsieh等，2010; Lee等人，2011）。樟基因组测序，研究人员发现樟基因组有可能的PKS基因14米的片段，其中包括的编码PKS 2000（Lu等，2014）四种基因的氨基酸数基因组分析项目组牛樟获得PKS基因AcPKS2基因的高度降低。
没有报道与化合物聚酮化合物合酶基因之间的链路上，本研究的目的是从在基因组中的芝聚酮化合物合酶基因分离，并且在各种培养条件下研究其表达，以及确定化合物之间接触基因的最终目标。因的这项研究中，并通过含有已知AcPKS2 HR-特定PKS域β-酮还原酶（KR）的蛋白质生物信息学分析领域，和烯酰还原酶（ER）其AcPKS2蛋白质序列分析，推断出基因属于HR-PKS;含有蛋白质分析的结构域AcPKS2释放结构域硫酯酶（TE）。TE C-末端结构域通常位于许多真菌聚酮化合物合酶未还原的TE域负责催化环化反应，以形成大环内酯（都＆娄，2010）和聚酮化合物释放但不TE结构域存在于HR -PKS在报告中。非还原末端结构域聚酮化合物合酶和功能上类似于TE域C-也释放还原酶结构域（R）（Kroken等人，2003），C-终端类酯酶/脂酶（IS）字段（石内等人，2012），金属-β-内酰胺酶（MβL）水解酶（Scherlach等人，2010）等。些酶的功能结构域已经被实验证明，如Fujii等人（2001）的异源基因PKS WA-修饰的C-末端结构域的过表达参与第一次证明环化反应TE克莱森领域克莱森型被命名字段环化酶（CTC），参与催化WA萘聚酮化合物合酶酮（naphthopyrone）第二芳环的环化克莱森式构巢曲霉（构巢曲霉）; R＆LT域催化还原作用由异源源，比是域TE域/ CLC属于丝氨酸水解酶家族稍大的表达（释放确认（Bailey等人，2007）石打等，2012）;通过基因敲除的证据MβL域的方式参与构巢曲霉APTA（asperthecin PKS）聚酮释放产品（Szewczyk等，2008）。
白质序列AcPKS2 TE粘附孔菌棕色域卷积（XP_.1）（Floudas等人，2012）的同源性结构域TE是56.49％，并且其被保持活性部位KQPXGPY。类分析可操作基因或类似的蛋白可以被分组到一个，在本研究蛋白质AcPKS2和未知化合物的其它三个功能PKS蛋白的聚乙烯，据推断含有TE域新AcPKS2基因HR- PKS。不同的媒体和培养的方法和牛樟芝的增长速度显著影响其活性成分（Zhao等人，2016年..周璇等人，2017年），而在不同的生长条件相同的基因，将有在基因表达的差异，并且可以产生不同的化合物，这种现象可以通过“细菌多个产品”（许多化合物OSMAC的菌株）进行说明。普希尔等人，（2017），使用从五个化合物获得内生菌菌株镰三重峰（tricinctum镰刀菌）在成功“的细菌产生的多”的策略，两个新fusarilelin化合物K和L以及fusarilelin两种已知类型甲fusarilelin化合物的fusarilelin和B，和化合物J的fusarilelin的量增加了80倍。
这项研究中，将含有不同碳源和氮源和商业添加剂AcPKS2基因的培养基中诱导表达，实验表明，与不同的碳源，葡萄糖和果糖的各种添加剂的基因的AcPKS2诱导表达的添加剂氮试验表明的必要条件下一致的碳源，所述酵母提取物的最高表达，番茄粉末下落的最低表情，不同的企业文化的测试显示出最高的表达TMG，SA最低。结果表明，在樟AcPKS2基因在不同的培养条件下，具有大的差异的表达水平可以被获取为聚酮化合物在大规模发酵途径中的下一个步骤樟最佳方式。果有助于异源表达樟聚酮化合物，和提高的驰调节合成基因的聚酮化合物樟基本分析的有效性。
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